Janice Reis Ciacci Zanella - Med. Veterinária, M.Sc., PhD, Pesquisadora Virologia - Embrapa Suinos e Aves, Concordia, SC. janice@cnpsa.embrapa.br
Nelson Morés - Med. Veterinário, M.Sc, Pesquisador Patologia - Embrapa Suinos e Aves, Concordia, SC.
Camila Sá Rocha - Med. Veterinária, M.Sc., CAV- UDESC, Lages, SC.
Giseli Ritterbusch - Med. Veterinária, M.Sc., CAV- UDESC, Lages, SC.
Elena Souza de Lima Med. Veterinária, M.Sc., CAV- UDESC, Lages, SC.
Introdução:
A síndrome da circovirose suína é um conjunto de seis manifestações clínicas causada pela infecção do circovirus suíno tipo 2 ou PCV2, um vírus patogênico, identificado pela primeira vez em 1997 que atualmente está disseminado em rebanhos suínos mundialmente. No Brasil o PCV2 foi identificado pela primeira vez em 2000, no Laboratório de Sanidade da Embrapa Suínos e Aves em Concórdia, SC. Atualmente a circovirose é endêmica devido à elevação do número de casos clínicos com confirmação laboratorial diagnosticados em rebanhos suínos brasileiros. A síndrome multisistêmica do definhamento dos suínos (SMDS) é a forma clínica mais freqüente e melhor caracterizada da infecção pelo PCV2. Dentre as outras, merece destaque por estarem cada vez mais relevantes, os distúrbios reprodutivos causados pelo PCV2, pois assim como a SMDS, pode ser reproduzida após a infecção experimental com o PCV2. As falhas reprodutivas causadas pela infecção do PCV2 ocorrem com o envolvimento ou não de outros patógenos infecciosos como o parvovírus suíno (PVS), o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRSV) e torque teno virus suíno (TTV). Todavia, não se conhece o envolvimento destes ou outros agentes infecciosos nestas falhas reprodutivas causadas pelo PCV2 no Brasil, o que dificulta o seu controle. O objetivo desta palestra é apresentar os resultados de pesquisa realizados na Embrapa Suinos e Aves onde o PCV2 foi diagnosticado em infecções naturais onde existia falhas reprodutivas e sua presença foi relacionada com outros agentes infecciosos causadores de patologia reprodutiva no plantel. Serão apresentados tres trabalhos principais realizados no ambito do projeto. Para a realização dos trabalhos, amostras provenientes de casos clínicos de campo (fetos abortados, mumificados, natimortos ou leitões inviáveis) ou material de fêmeas descarte em abatedouros foram coletados e enviados ao laboratório por parceiros da assistência técnica que seguiram um questionário e protocolo de coleta. No laboratório foram empregadas metodologias de diagnóstico específicas já em uso, como a imunoistoquímica (IHQ), reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização in situ (ISH) para diagnóstico de PCV2 nestes materiais. Para o diagnóstico do PRRSV, PVS, TTV o projeto propos a implantação e aplicação de sorologia, IHQ, PCR, RT-PCR (PCR e transcriptase reversa) e/ou isolamento viral. Para um diagnóstico seguro, é necessário, um processo ou conjunto de análises que complementem o diagnóstico laboratorial. O esclarecimento da etiologia da doença se faz necessário, principalmente o papel de outros agentes patogênicos que podem estar envolvidos agravando as perdas e dificultando o controle destas doenças. Diagnósticos diferenciais como sorologia, análises histopatológicas e/ou bacteriologicos foram realizados para outras doenças como toxoplasmose, brucelose, leptospirose, erisipela suína, doença de Aujeszky, PRRS, PVS e peste suína clássica (PSC). A meta deste projeto foi oferecer uma carteira de processos e metodologias de diagnóstico para patógenos causadores de falhas reprodutivas e sistêmicas, de importância para o mercado interno e exportador pois assim como o PCV2, agentes exóticos como o PRRSV é uma ameaça à cadeia. A disponibilização destas ferramentas de diagnóstico realizadas no âmbito deste projeto tanto no laboratório executor como no laboratório CEDISA, participante ativo em várias atividades vai alavancar pesquisas futuras da etiologia, caracterização molecular, epidemiologia e controle destes problemas sanitários em rebanhos suínos, pois vai incrementar a vigilância sanitária, favorecendo a maior competitividade da suinocultura brasileira frente a desafios sanitários atuais e potenciais.
Pesquisas realizadas:
1) ESTUDO DA PATOGENICIDADE E INVESTIGAÇÃO DE CO-INFECÇÃO POR CIRCOVIRUS SUÍNO TIPO 2 (PCV2) E TORQUE TENO VÍRUS SUÍNO (TTV) EM MATERIAL PROVENIENTE DE PORCAS COM PATOLOGIAS REPRODUTIVAS
Muitos agentes infecciosos têm sido associados às falhas reprodutivas na produção de suínos, representando significativas perdas econômicas para os suinocultores. Para confirmar o potencial patogênico do PCV2 causando falhas reprodutivas em porcas, é necessário o isolamento do vírus e demonstração de antígeno e ácido nucléico viral em fetos. Outro agente viral, o Torque Teno Vírus (TTV), também foi recentemente associado às infecções causadas pelo PCV2. O TTV sozinho ainda não tem se mostrado patogênico em suínos, porém, seu papel em co-infecções com outros patógenos vem sendo investigado. O presente trabalho teve por objetivos diagnosticar o PCV2 em infecções naturais onde existiam falhas reprodutivas, assim como padronizar e aplicar a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para TTV a partir de órgãos. Amostras provenientes de casos clínicos de campo, como fetos abortados, mumificados, natimortos, leitões inviáveis e material de fêmeas descartadas foram coletadas e processadas para diagnóstico da infecção pelo PCV2 através de PCR e imunoistoquímica (IHQ). Foram colhidas amostras de 21 granjas produtoras de suínos, totalizando 169 fetos, que foram necropsiados para coleta de órgãos. Além disso, amostras de órgãos reprodutivos de 83 fêmeas descartadas foram colhidas em 4 abatedouros da região oeste catarinense. No presente estudo foi possível detectar DNA viral por PCR em 29 (17,1%) dos 169 fetos analisados, sendo coração e tecidos linfóides os órgãos onde o vírus foi identificado com maior freqüência, 41,4% e 37,8%, respectivamente. A presença do vírus foi confirmada por teste de IHQ dos tecidos, sendo encontrado antígeno viral em 17 fetos positivos para PCV2 por PCR. As amostras de tecido reprodutivo das fêmeas também foram testadas por PCR e o PCV2 foi identificado em 4 porcas (4,8%). Visando a detecção de TTV foram testadas por PCR amostras de órgãos reprodutivos de fêmeas suínas, sendo diagnosticados os dois genogrupos de TTV, TTV1 e TTV2 em 25 (30,1%) e 41 (49,3%) fêmeas, respectivamente. As amostras de fetos que resultaram positivas para PCV2 pela técnica de PCR também foram testadas para TTV, observando-se a ocorrência de coinfecção entre estes agentes. Os resultados obtidos evidenciam o provável envolvimento do PCV2 em falhas reprodutivas em fêmeas suínas, bem como mostram que o TTV está presente nas amostras analisadas, confirmando a associação com o PCV2.
2) DETECÇÃO DE PARVOVÍRUS SUÍNO EM MATERIAL PROVENIENTE DE PORCAS COM PATOLOGIAS REPRODUTIVAS
A parvovirose suína é uma doença causadora de falhas reprodutivas e seu agente etiológico é o Parvovírus Suíno Tipo 1 (PVS1). Essa enfermidade, de alta prevalência e distribuição mundial, afeta principalmente porcas nulíparas não imunes. Clinicamente observa-se retorno ao cio, atraso na data de parição, nascimento de leitões inviáveis, fracos, natimortos e, principalmente, mumificados em diferentes tamanhos. Estes problemas reprodutivos acarretam prejuízos econômicos demonstrados pelos baixos índices produtivos. O presente trabalho objetivou implantar e validar técnicas de diagnóstico laboratorial para PVS1 em infecções naturais em rebanhos suínos que apresentam problemas reprodutivos e realizar caracterização desses isolados. Mais especificamente, objetivou-se diagnosticar, através de nested-PCR, e caracterizar, através de análise filogenética, isolados de PVS1 em amostras de tecidos e líquido estomacal de fetos e em aparelho reprodutivo de porcas descartadas. Objetivou-se ainda avaliar histologicamente os tecidos que resultaram positivos na nested-PCR; padronizar um controle interno de amplificação (CIA) para a nested-PCR de PVS1 e padronizar técnica de imunohistoquímica (IHQ) em tecidos fetais. De 27 rebanhos de suínos, foram colhidos 230 fetos entre natimortos, mumificados e abortados, os quais foram necropsiados para colheita de órgãos e líquido estomacal. O DNA viral foi detectado por nested-PCR em órgãos de seis (2,61%) fetos dos 230 analisados, sendo o cerebelo e a medula os órgãos onde o vírus foi detectado com maior frequência (50%). Líquido estomacal de três (2,75%) fetos foram positivos por nested-PCR, de 109 analisados. Além disso, amostras de órgãos reprodutivos de 83 porcas descartadas foram colhidas e também fluido folicular ovariano de 71 delas. O material genético do PVS1 foi diagnosticado em órgãos de seis porcas (7,23%) e em fluido folicular de três (4,22%) delas. De 19 órgãos positivos de fetos na nested-PCR, quatro tiveram lesão histológica. De seis ovários e seis úteros das seis fêmeas suínas descartadas positivas na nested-PCR, cinco ovários estavam ciclando, um estava em anestro e quatro úteros tinham algum grau de endometrite. O CIA desenvolvido para a nested-PCR foi amplificado em todas as reações, conforme o esperado. Nos testes de IHQ a presença do vírus foi confirmada em tecido fetal. Os resultados obtidos no estudo evidenciam baixa freqüência do PVS1 nos rebanhos analisados, bem como nos órgãos reprodutivos de porcas descartadas, considerando baixo o envolvimento do PVS1 nas falhas reprodutivas.
3) DIAGNOSTICO SOROLOGICO DE DOENÇAS INFECCIOSAS CAUSADORAS DE FALHAS REPRODUTIVAS EM SUINOS
O presente estudo objetivou realizar sorologia diferencial para agentes infecciosos causadores de falhas reprodutivas em infecções naturais de fêmeas suínas. Para isso, foram selecionadas um total de 27 granjas produtoras de leitões onde ocorram problemas reprodutivos no plantel, e a correlação com a infecção por PVC2 foi pesquisada. Foram amostradas um total de 321 amostras de 120 fêmeas e de suas respectivas leitegadas, colheu-se líquido das cavidades de dois leitões por leitegada oriundos de partos prematuros ou a termo (fetos mumificados, natimortos ou leitões inviáveis). No laboratório foram empregados exames sorológicos específicos já em uso para Parvovirose suína, Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRS), Doença de Aujeszky (DA), Peste Suína Clássica (PSC), Circovirose Suína, Brucelose, Leptospirose, Erisipela Suína e Toxoplasmose. No presente estudo foi possível verificar que todas as matrizes reagiram sorologicamente para circovirose e 8 fetos (3,98%) também. Das fêmeas, 94,17% apresentaram resultado indicativo de infecção para parvovirose e dos seus leitões 2,99% foram positivos. Das fêmeas testadas para Leptospirose, 0,83% apresentaram titulo 1:100 para o sorovar L. grippotiphosa e 1,67% com titulo reagente1:400 para o mesmo sorovar. Nenhum dos fetos apresentou aglutinação neste teste. Foram identificadas 13,4% de porcas soropositivas para Erisipela. Nenhuma porca foi positiva para PRRS, VDA e PSC, brucelose e toxoplasmose. Nenhum feto foi positivo para brucelose, mas 4,48% apresentaram título sugestivo de infecção pelo Toxoplasma gondii.Os títulos de anticorpos indicativos de infecções virais tiveram maior freqüência (64,17%) do que os títulos de anticorpos indicativos de infecções bacterianas (15%). Os resultados obtidos evidenciam que a circovirose suína foi a infecção mais prevalente e que mais estudos são necessários para avaliar a patogenia do PCV2 em falhas reprodutivas e as possíveis interações de outros agentes com a ocorrência de Circovirose.
Conclusões dos estudos realizados e recomendações:
Em 2009-2010 foram realizadas várias pesquisas (Ritterbusch, 2009; Rocha, 2010; Lima, 2010) em fetos abortados, natimortos, mumificados e inviáveis e em suas respectivas mães, envolvendo 27 rebanhos, 120 porcas e 320 fetos, com objetivo de identificar os principais agentes infecciosos envolvidos em falhas reprodutivas em rebanhos suínos do sul do Brasil. Foram examinados fetos apenas de porcas que tinham abortado ou parido pelo menos 2 natimortos, mumificados ou leitões inviáveis (de 3-5 porcas/granja). No exame histológico dos principais órgãos internos, apenas 17,24% dos fetos apresentavam alterações de natureza inflamatória, indicando que a maioria das causas dos fetos abortados, natimortos, mumificados ou inviáveis parece não ser de origem infecciosa. O coração e os tecidos linfóides foram considerados os órgãos de eleição para diagnóstico de PCV2 em tecidos fetais. Dentre os agentes infecciosos relacionados com problemas reprodutivos, o PCV2 foi o mais freqüente, com 15,9% de fetos positivos. O PVS foi detectado em apenas 2,6% dos fetos avaliados e a técnica de nested-PCR foi melhor que a da IHQ para identificação do vírus nos tecidos. Porém, o exame sorológico do exsudato fetal do pulmão foi um bom indicativo da infecção fetal pelo PVS . No exame sorológico da mães dos fetos não foram identificados anticorpos contra o vírus da PRRS, indicando ausência da infecção nas porcas estudadas. Também, não foram detectados anticorpos nas mães contra as doenças reprodutivas convencionais como DA, PSC, brucelose, leptospirose e toxoplasmose em que o Brasil não é considerado livre. Embora tenha sido elevada a freqüência de títulos de anticorpos considerados não vacinais para o PCV2 e PVS nas porcas, não está claro a relação entre esses títulos com a ocorrência de fetos natimortos, mumias, abortados ou inviáveis.
Embora a freqüência de envolvimento de agentes infecciosos em problemas de nascimento de leitões natimortos, mumificados ou inviáveis não é elevadas (30-40%), quando há suspeita de doença infecciosa devem ser remetidos ao laboratórios fetos de 3-5 porca/granja e 2 fetos/porca, preferencialmente resfriado. Dependendo da situação, o exame sorológico de uma amostragem de soro de porcas ou soros pareados podem trazer informações importantes para o diagnóstico. Como existem muitos agentes que podem causar sintomas reprodutivos semelhantes, é importante que o veterinário de campo faça uma avaliação detalhada do rebanho (anamnese, avaliações clínica, epidemiológica e dos registros reprodutivos da granja detalhados dos últimos 6 meses) para orientar o laboratório de quais exames seriam prioritários realizar. Isso pode baixar custos e possibilita chegar a um diagnóstico mais preciso.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
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RITTERBUSCH, G.A. ESTUDO DA PATOGENICIDADE E INVESTIGAÇÃO DE CO-INFECÇÃO POR CIRCOVIRUS SUÍNO E TORQUE TENO VÍRUS SUÍNO EM MATERIAL PROVENIENTE DE PORCAS COM PATOLOGIAS REPRODUTIVAS. Dissertação (mestrado), Centro de Ciências Agroveterinárias/UDESC. 2009. 76p.
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SOBESTIANSKY, J.; BARCELLOS, D. Doenças dos Suínos. Goiânia: Cânone Editorial. 768p, 2007.
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